51����

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit menular yang merupakan penyebab utama kematian oleh karena infeksi secara global. Tuberkulosis disebabkan infeksi basil Mycobacterium tuberculosis (MTB). Prioritas utama program pengendalian TB, termasuk penegakan diagnosis TB paru aktif (PTB) yang akurat dan cepat. Pendekatan ini bertujuan untuk mencegah transmisi MTB dan menyediakan terapi yang tepat untuk pasien TB. Laboratorium mikrobiologi penting dalam menegakkan diagnosis definitif berdasarkan deteksi, identifikasi, dan uji kepekaan agen penyebab TB melalui metode kultur. Beberapa penelitian menemukan berbagai fenotipe MTB dalam sampel dahak dari pasien dengan PTB aktif, termasuk aktif bereplikasi dan yang tidak bereplikasi atau bakteri dorman, 80 hingga 99% dari populasi MTB dalam dahak pasien PTB tidak aktif. Bakteri MTB yang tidak aktif tidak bisa tumbuh pada media standar yang digunakan untuk diagnosis saat ini, menghasilkan kesalahan diagnosis negatif. Kondisi ini adalah reversibel, dan sel bakteri dapat melanjutkan aktivitas metabolisme saat terpapar media kaya atau filtrat hasil kultur (CF=culture filtrate) mereplikasi mikobakteri. Filtrat kultur MTB yang sedang tumbuh mengandung faktor pemicu resusitasi (Rpfs). Resusitasi faktor adalah keluarga protein yang disekresikan yang dapat menghidupkan kembali bakteri yang tidak bereplikasi, pertama kali ditemukan pada Micrococcus luteus. MTB memiliki lima gen seperti Rpf (Rpf A-E), yang menunjukkan aktivitas biologis mirip dengan Rpfs pada Micrococcus luteus. Faktor resusitasi kuat menghidrolisis peptidoglikan pada dinding sel MTB pada konsentrasi picomolar, untuk merangsang bakteri keluar dari tahap dormansi. Sebuah studi menunjukkan bahwa CF dari galur MTB H37Rv yang tumbuh, dapat meningkatkan sensitivitas kultur dan mempercepat waktu untuk mendeteksi MTB. Kultur cairan bebas sel di fase eksponensial kultur MTB menunjukkan efek resusitasi secara substansial meningkatkan kapasitas pertumbuhan sel yang tidak dapat dikulturkan dalam media cair. Waktu deteksi (Time to detection = TTD) MTB dalam media cair komersial MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube = Tabung Indikator Pertumbuhan Mycobacteria) 960 sistem berkisar antara 6 sampai 10 hari. Menurut sebuah penelitian, TTD MTB di MGIT 960 untuk apusan BTA positif adalah 16 hari, sedangkan TTD untuk BTA negative spesimen adalah 20 hari. Waktu yang dibutuhkan untuk kultur masih cukup lama, yang bisa mengakibatkan keterlambatan penanganan pasien. Suplemen kultur filtrat H37Rv mengandung Rpfs menimbulkan prospek meningkatkan sensitivitas dan mempercepat waktu kultur MTB. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan tingkat pemulihan MTB dan TTD dalam media cair komersial MGIT 960 dengan dan tanpa suplemen filtrat kultur H37Rv.

Metode penelitian: studi eksperimen laboratorium, membandingkan dua kelompok uji, MGIT 960 (BD BACTEC™ MGIT™ 960 Sistem Kultur Mikobakteri, BD Biosciences, Sparks, USA) dengan dan tanpa suplementasi CF H37Rv. Penelitian pada 15 dahak sampel pasien PTB, dikumpulkan antara 20 Oktober sampai 22 November 2021. Sampel dahak dikumpulkan dari pasien dugaan TB paru pada Klinik Paru di RSUD Dr Soetomo, dikirim dahak untuk uji Xpert MTB/RIF (Xpert® MTB/RIF, Cepheid®, Sunnyvale, AS), di laboratorium mikrobiologi klinik. Kriteria inklusi: dahak sampel dengan uji Xpert MTB/RIF hasil �MTB terdeteksi�. Sampel dahak yang tidak ada pertumbuhan di kedua media tersebut, MGIT dan MGIT+CF H37Rv, serta sampel yang terkontaminasi selama proses kultur, dikeluarkan dari penelitian ini. Persiapan Filtrat Kultur H37v, stok koloni MTB H37Rv yang tumbuh aktif pada medium Lowenstein Jensen (LJ), dilakukan homogenisasi dalam medium cair Middlebrook 7H9, suspensi Mcfarland 0,5. Total dari 100 μL dari suspensi Mcfarland 0,5 diinokulasi ke tabung MGIT yang dilengkapi dengan asam oleat-Albumin-Dekstrosa Katalase (OADC) (BD Bactec MGIT system 960, Becton Dickinson) dan kemudian diinkubasi pada 37˚C selama 12 hari (fase pertengahan log) di Mesin sistem MGIT 960. Tabung MGIT dikeluarkan dari mesin MGIT 960 setelah 12 hari. Pewarnaan Ziehl Nelsen (ZN) dilakukan untuk memastikan bahwa basil tahan asam (AFB) ada dalam tabung MGIT-positif, penenaman pada media Agar Darah (BBL Trypticase Soy Agar) dilakukan untuk memastikan tidak ada kontaminan yang tumbuh. Tabung MGIT bebas kontaminan disentrifugasi selama 20 menit pada 3000 g pada 4⁰C. Filter Minisart™ 0,2 µm digunakan untuk menyaring supernatan. Pewarnaan ZN dilakukan untuk memastikan tidak ada AFB sel disaring dalam filtrat kultur. Filtrat CF diuji sterilitasnya dengan cara diinokulasi 500 μL produk yang disaring ke dalam tabung MGIT dan diinkubasi pada mesin MGIT sistem 960. Filtrat kultur dijaga pada suhu -80⁰ C sampai tiba waktunya untuk digunakan. Pengaruh CF H37Rv terhadap TTD bisa diklasifikasikan menjadi tiga kategori: 1) TTD penurunan >10 jam (promosi pertumbuhan), 2) Perpanjangan TTD >10 jam (pertumbuhan inhibitor), dan 3) selisih TTD < 10jam (tidak ada perubahan TTD). Kultur dahak TBC diawali dengan proses dekontaminasi menggunakan 4% NaOH. Setelah menambahkan NaOH ke dalam perbandingan 1:1 dengan specimen dahak, dan divorteks, tabung didiamkan sekitar 15-20 menit. Setelah 15-20 menit, garam penyangga fosfat (PBS) (pH 6,8) ditambahkan sampai tabung tercapai 50ml. Spesimen disentrifugasi selama 15-20 menit pada 3000g. Supernatannya dibuang ke tempat yang mengandung disinfektan. Sedimen diresuspensi dalam 1-2 mL PBS (pH 6,8). Pelet 500 μL/suspensi sedimen digunakan untuk inokulasi dalam tabung MGIT, dengan satu tetes digunakan untuk sediaan apusan. Tabung MGIT positif kurang dari 7hari dianggap MGIT positif awal, yang berarti tabung MGIT positif dengan hasil tes konfirmasi negatif. Buat olesan 1-2 tetes cairan positif MGIT pada objek kaca yang bersih. ZN pewarnaan dilakukan untuk melihat keberadaannya atau tidak adanya AFB. Tabung MGIT yang positif juga diinokulasi pada Agar Darah untuk lihat apakah tumbuh kontaminan bakteri atau jamur. Agar Darah diinkubasi dalam CO2 inkubator selama 48-72 jam. Tabung dengan kontaminan tidak analisis. Tabung dengan smear positif BTA dan tidak ada kontaminan dinyatakan sebagai hasil kultur positif.

Hasil Penelitian, karakteristik sampel, semua sampel dahak dengan uji Xpert MTB/RIF positif untuk MTB atau �MTB Terdeteksi,� dengan 11 orang (73%) sensitif terhadap rifampisin(RIF), 3 orang (20%) resisten RIF, dan satu orang (7%) tidak tentu sensitivitasnya terhadap RIF. Berdasarkan riwayat pengobatan 12 pasien (80%) adalah kasus baru, dan tiga kasus pengobatan ulang (20%). Konsistensi sampel dahak terdiri dari delapan sampel purulent (53%), lima sampel lendir (33%), dan dua sampel dahak berdarah (13%). Pewarnaan ZN pada sampel dahak AFB 1+ pada 7 pasien (47%), AFB 2+ pada 3 pasien pasien (21%), dan AFB 3+ pada 5 pasien (33%). Sejak sampel tiba sampai dekontaminasi dan kemudian dilakukan kultur, waktu penyimpanan berkisar dari 1 hingga 12 hari. Volume sampel berkisar antara 2 cc dan 5 cc. Pada kedua kelompok, tingkat pemulihan adalah 100%, dari saat sampel tiba sampai dibiakkan, waktu penyimpanan berkisar antara 1 hingga 12 hari, dengan rata-rata waktu penyimpanan sekitar 3,93 hari. Waktu penyimpanan ini kurang dari dua minggu tidak mempengaruhi kelangsungan hidup MTB dalam sampel. Perbedaan Waktu Deteksi (ΔTTD) pertumbuhan MTB dalam media cair umumnya memakan waktu 6-10 hari. Pada manual kultur MTB, TTD dalam media cair (MGIT) dibagi menjadi <7 hari (<168 jam) dan ≥ 7 hari (≥ 168 jam). Pada penelitian ini, ada enam sampel dengan TTD < 7 hari (< 168 jam) dan sembilan sampel dengan TTD ≥ 7 hari (≥ 168 jam) pada kelompok MGIT standar. Sedangkan pada kelompok MGIT+CF H37Rv, ada delapan sampel dengan TTD < 7 hari (< 168 jam) dan tujuh sampel dengan TTD ≥ 7 hari (≥ 168 jam). Sampel dengan TTD <7 hari juga menunjukkan adanya pertumbuhan MTB.

Pembahasan, TTD di kelompok eksperimen umumnya lebih cepat dari TTD pada kelompok kontrol. Empat belas dari lima belas sampel (93%) diinokulasi ke dalam tabung MGIT+CF H37Rv dengan TTD lebih cepat dibandingkan kelompok kontrol. Studi sebelumnya menemukan bahwa Rpfs dapat memperpendek waktu fase lag phase dan menyebabkan mikobakteri segera masuk ke fase log phase. Pertumbuhan eksponensial mikobakteri pada fase log phase mengkonsumsi sejumlah besar oksigen. Ini menyebabkan fluoresensi terakumulasi dalam tabung MGIT, memungkinkan sinyal positif untuk dideteksi lebih cepat. Pada kelompok kontrol, 60% sampel mengalami TTD ≥ 7 hari, padahal hanya 46% sampel pada kelompok eksperimen mempunyai TTD ≥ 7 hari. Suplementasi CF H37Rv lebih bermanfaat pada sampel dengan beban bakteri rendah. Temuan penelitian ini mendukung temuan sebelumnya bahwa efek CF H37Rv adalah lebih menonjol pada sampel dengan beban bakteri rendah, seperti BTA-negatif, Xpert MTB/RIF positif dengan siklus tinggi nilai ambang batas (Ct), atau Xpert MTB/RIF sampel negatif. Penelitian lain menemukan bahwa penambahan CF H37Rv menurun waktu TTD dari 9 hari hingga 6 hari (p ≤ 0,001) dan meningkatkan beban basiler pada kultur dahak sebelum dan sesudah kultur sebesar 30%. Pemendekan TTD dengan penambahan CF H37Rv tidak dikaitkan dengan pola kerentanan MTB terhadap RIF. Temuan ini konsisten dengan penelitian yang menunjukkan bahwa CF dapat digunakan untuk mendeteksi Differentially Culturable Tubercle Bacteria (DCTB) dari strain yang resistan terhadap obat. Suplementasi CF-H37Rv menunjukkan pertumbuhan yang lebih signifikan efek peningkatan pada sampel yang diambil lebih lama untuk menjadi positif. Penelitian sebelumnya menggunakan RpfB rekombinan dan RpfE dalam sampel dahak dikonfirmasi mengandung MTB dengan mikroskop fluoresensi, menemukan bahwa terjadi penurunan TTD hanya pada sampel dengan TTD lebih besar dari 20 hari. Sumber filtrat kultur penelitian ini adalah strain MTB H37Rv yang virulens, yang memerlukan penanganan yang hati-hati dan keamanan hayati tingkat tinggi. Sebuah studi yang menyelidiki sumber filtrat kultur untuk resusitasi DCTB menemukan CF itu dari H37Ra, Mycobacterium smegmatis, W-Beijing, dan strain Erdmann mempunyai pengaruh yang signifikan efek resusitasi dalam meningkatkan jumlah CFU MTB dalam sampel. Penelitian lain menemukan CF dari Mycobacterium smegmatis tidak punya efek resusitasi pada MTB dorman. Menambahkan Rpf ABMTB dan Rpf ABCDEMTB ke Mycobacterium smegmatis, CF mengakibatkan sedikit peningkatan namun signifikan secara statistik dalam tingkat pemulihan DCTB. Penelitian ini dibatasi oleh kelompok kecil ukuran sampel dan pemilihan sampel dahak, yang hanya menyertakan sampel dengan �MTB terdeteksi� pada Xpert MTB/ RIF. Berdasarkan temuan ini, menunjukkan efek CF H37Rv lebih menguntungkan dalam sampel dengan muatan bakteri rendah, penelitian di masa depan dapat fokus pada pasien dengan tuberkulosis paucibacillary, seperti dalam kasus TB di luar paru (EPTB) dan TB-HIV, kasus pengobatan ulang, kasus kronis, tahapan perawatan lanjutan lainnya, dan pasien dengan gejala klinis TB namun metode kultur menunjukkan hasil negatif. Kelemahan pada penelitian ini adalah penggunaan CF H37Rv, strain MTB yang virulens membutuhkan kehati-hatian yang ekstrim dan memakan waktu yang lama untuk tumbuh. Sumber CF dari mikobakteri lainnya, berkembang pesat dan kurang ganas dapat dipertimbangkan pada studi masa depan.

Kesimpulan penelitian ini, Tingkat pemulihan pertumbuhan mikobakteri dan TTD pada kelompok MGIT+CF H37Rv dan kelompok MGIT standar adalah tidak berbeda secara statistik. Suplementasi Filtrat kultur tidak menguntungkan semua jenis spesimen secara merata. Suplemen filtrat kultur H37Rv memiliki lebih banyak keuntungan yang signifikan pada sampel dengan beban bakteri rendah (AFB 1+) dan sampel dengan waktu yang lebih lama untuk menjadi positif [TTD ≥7 hari (≥ 168 jam).

Penulis: Resti Enggar Paweninggalih, Ni Made Mertaniasih, Eko Budi Koendhori, Soedarsono

Informasi detail riset ini dapat dilihat pada tulisan:

; doi: 10.15562/bmj.v12i1.3833; Resti Enggar Paweninggalih, Ni Made Mertaniasih, Eko Budi Koendhori, Soedarsono. 2023; Time to detection of Mycobacterium tuberculosis using culture filtrate H37rv supplementation on MGIT 960 System; Bali Medical Journal 2023; 12(1): 228-234