Strategi baru berhasil dikembangkan untuk mengatasi biofilm P. aeruginosa khususnya pada pneumonia. Biofilm merupakan faktor virulensi P. aeruginosa, yang meningkatkan resistensi bakteri sehingga bakteri lebih sulit untuk dibunuh. Mereka sangat resisten terhadap respons imun dan ribuan kali lebih resisten terhadap antibiotik. Problema peningkatan resistensi antibiotik di seluruh dunia serta tingkat mortalitas/morbiditas yang tinggi pada pneumonia telah mendorong penelitian tentang strategi terapi baru untuk mengatasi infeksi biofilm tunggal dan polimikroba, terutama pada pneumonia, dengan menggunakan agen antibiofilm.
Telah dilakukan asesmen terhadap eksplorasi beberapa antibiofilm P. aeruginosa berdasarkan inhibitor kompetitif enzim PMM/PGM, yang bertanggung jawab untuk biosintesis matriks ekstraseluler. Dalam penelitian ini, diidentifikasi senyawa-senyawa dengan struktur yang mirip dengan situs aktif PMM/PGM, yang berfungsi sebagai ligan untuk enzim ini. Ligan meliputi substrat asli PMM/PGM (mannosa dan glukosa), serta ligan PMM/PGM S108A (asam tartarat/TLA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa tiga senyawa, yaitu asam askorbat [AA], asam glukarat [GA] dan D-sorbitol [DS] memenuhi kriteria. Berdasarkan kesamaan struktur antara ligan ini dan TLA (sebagai substrat alami PMM/PGM), ligan harus menempati situs aktif PMM/PGM. Dengan demikian, ligan-ligan tersebut diharapkan dapat menghasilkan aktivitas sebagai inhibitor kompetitif PMM/PGM, yang dapat diprediksi melalui analisis in silico, kemudian diindikasikan aktivitasnya melalui uji in vitro.
Studi teoritis tentang penggunaan analog substrat sebagai penghambat PMM/PGM berdasarkan kesamaan struktural (mimic) dengan ligan asli dan ketersediaan komersialnya menunjukkkan pendekatan yang efisien dalam mendesain obat. Selain itu, mekanisme penghambatan kompetitif PMM/PGM dianalisis berdasarkan interaksi inhibitor dengan residu pada situs aktif reseptor pada tingkat molekuler. Redocking menentukan situs aktif PMM/PGM berdasarkan interaksinya dengan TLA sebagai ligan asli. Analisis docking molekuler dari ligan PMM/PGM menunjukkan bahwa setiap ligan memiliki konformasi yang sangat baik dengan skor grid negatif.
Studi farmakokinetik in silico menunjukkan bahwa setiap ligan inhibitor memenuhi kriteria obat oral yang baik , karena memiliki ≤ 2 penyimpangan. Selanjutnya prediksi ini dibuktikan melalui uji in vitro kuantitatif dan kualitatif.
Uji in vitro pertama menggunakan metode kristal violet mengkonfirmasi bahwa keempat senyawa ligan dapat menghambat biofilm P. aeruginosa. Menggunakan analisis spektrofotometri dan metode kristal violet, pembentukan biofilm ditentukan berdasarkan densitas optik. Eksperimen in vitro menunjukkan aplikasi potensial dari senyawa ini sebagai agen antibiofilm.
Uji in vitro kedua menggunakan metode biofilm koloni yang cocok untuk menilai kekuatan suatu antibiotik atau resistensi terhadap antibiotik. Membran nitroselulosa adalah permukaan yang baik untuk menumbuhkan biofilm P. aeruginosa, memungkinkan pasokan nutrisi baru hanya dengan mentransfer sel yang ditumbuhkan membran ke piring agar segar. Oleh karena itu, seseorang dapat dengan mudah mengganti sumber karbon atau jenis pengobatan antibiotik tanpa mencuci sel. Tampilan makroskopis dari biofilm P. aeruginosa yang tidak diberi perlakuan lebih padat daripada biofilm yang diberi perlakuan ligan. Berdasarkan percobaan kualitatif ini, setiap ligan uji menunjukkan penurunan pembentukan biofilm P. aeruginosa. Evaluasi yang lebih rinci adalah struktur mikroskopis yang dilakukan dengan pemindaian mikroskop elektron (SEM).
Uji in vitro ketiga menggunakan SEM menunjukkan bahwa morfologi sel berubah setelah diberi perlakuan dengan ligan. Analisis SEM mengungkapkan bahwa biofilm P. aeruginosa (kontrol) yang tidak diobati terdiri dari sel bakteri dan matriks EPS. Biofilm P. aeruginosa yang ditumbuhkan secara in vitro dibentuk melalui beberapa tahapan. Pertama, bakteri planktonik menempel pada permukaan abiotik atau biotik melalui flagela dan adhesi. Kedua, keterikatan yang tidak dapat diubah akan terjadi dengan bantuan protein SadB. Ketiga, mikrokoloni terbentuk di lapisan kompleks biomolekul dan matriks EPS. Keempat, biofilm matang. Kelima, bakteri dilepaskan dari biofilm untuk membentuk biofilm baru.
Semua ligan yang diuji ditambahkan pada tahap pertama pembentukan biofilm, yakni ketika sel bakteri menempel pada permukaan kaca penutup. Berdasarkan tahapan pembentukan biofilm, matriks EPS akan mulai terbentuk pada tahap kedua. Oleh karena itu, ligan ditambahkan untuk menghambat proses ini melalui fungsinya sebagai analog substrat PMM/PGM. TLA dengan konsentrasi 4 mg/mL menunjukkan sel yang jarang tanpa EPS, yang mirip dengan penambahan GA (0,5 mg/mL), DS (400 mg/mL), dan AA (50 mg/mL). Penampakan dinding sel bakteri pada setiap perlakuan bervariasi. Sel yang diberi TLA dan GA, dinding sel beberapa bakteri lisis. Sementara itu pada sel yang diberi DS, pengaruh tekanan osmotik menyebabkan sel membengkak, sementara dinding selnya tetap utuh. Namun, EPS tidak ditemukan dalam sel yang diberi AA.
Eksperimen in vitro dalam penelitian ini membuktikan bahwa TLA, GA, DS, dan AA memiliki aktivitas yang sangat baik sebagai antibiofilm P. aeruginosa. Agen antibiofilm potensial ini dapat mencapai nilai penghambatan hampir 100% pada konsentrasi yang berbeda-beda. TLA, GA, DS, dan AA memiliki tingkat penghambatan biofilm >50% pada 2 × 103, 2,5 × 102, 4 × 105, dan 1,25 × 104 µg/mL. Uji membran nitroselulosa menunjukkan bahwa kontrol dan biofilm yang terpapar ligan memiliki penampilan yang berbeda. Gambar SEM mengungkapkan bahwa biofilm kontrol ditutupi oleh lapisan matriks EPS. Namun, penampakan matriks ini tidak ada pada biofilm yang diberi perlakuan ligan. Analisis docking molekuler menunjukkan bahwa setiap ligan memiliki afinitas pengikatan yang sangat baik pada reseptor, karena didukung oleh beberapa ikatan hidrogen. Selanjutnya, setiap inhibitor dapat menjadi kandidat obat yang menjanjikan berdasarkan sifat farmakokinetiknya. Analisis drug-likeness dan bioavailabilitas menunjukkan hasil yang baik, dimana semua kandidat antibiofilm menunjukkan tidak toksik dan memenuhi kriteria: non – toksik AMES, non-hepatotoksisitas, dan non sensitif.
Penulis: Prof. Dr. Afaf Baktir, Dra., M.S.
Link Jurnal:
