Tulang memiliki potensi regeneratif yang tinggi melalui pembentukan matriks tulang baru bukan pembentukan jaringan parut. Matriks tulang dihasilkan oleh osteoblas, yang berdiferensiasi dari sel osteoprogenitor yang berasal dari sel punca mesenkim (MSC). Proses ini memerlukan faktor osteoinduktif yang dikirim oleh pembuluh darah ke tempat pembentukan tulang, merekrut sel-sel progenitor, dan menginduksi diferensiasi osteoblas. Protein morfogenetik tulang (BMP) merupakan anggota superfamili faktor pertumbuhan transformasi-尾 (TGF-尾) yang telah diketahui dan ditetapkan dengan baik sebagai penginduksi kuat diferensiasi osteoblas.
BMP9, juga dikenal sebagai faktor pertumbuhan dan diferensiasi, dilaporkan memiliki potensi osteogenik terkuat di antara anggota BMP. Osteogenesis yang dimediasi BMP9 kemungkinan terjadi melalui jalur yang tumpang tindih dengan jalur pensinyalan dari anggota osteogenik lain dari keluarga BMP.
Hipoksia jaringan, baik patologis maupun lingkungan, dapat mempengaruhi metabolisme tulang. Komponen pengatur utama dari proses ini adalah hypoxia-inducible factor (HIF), faktor transkripsi yang memainkan peran penting dalam adaptasi seluler dan respon perkembangan terhadap hipoksia.
Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa tulang adalah salah satu jaringan yang paling hipoksia dalam tubuh manusia, sedangkan efek hipoksia pada pembentukan tulang belum sepenuhnya dijelaskan. Aktivitas HIF dalam osteoblas dilaporkan terkait dengan peningkatan angiogenesis jaringan tulang melalui induksi faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF). Selanjutnya, ekspresi HIF-1伪 dalam osteoblas dilaporkan dapat meningkatkan massa tulang melalui peningkatan glikolisis yang bersifat independen dari angiogenesis terkait-VEGF.
Saat menganalisis ekspresi protein pada osteoblast dengan stimulasi BMP9, kami menemukan bahwa tingkat ekspresi protein HIF-1伪 meningkat dalam kondisi normoksik. Atas temuan tersebut, kami lanjutkan dengan memeriksa tingkat ekspresi mRNA Hif-1伪 dari sel preosteoblas MC3T3-E1 setelah stimulasi BMP9 dan pula dalam keadaan hipoksia. Berbeda dengan tingkat ekspresi protein, tidak ada peningkatan yang jelas dari mRNA Hif-1伪 baik dalam kondisi paska stimulasi BMP9 atau hipoksia, serta kombinasinya.
Untuk menyelidiki mekanisme induksi ekspresi protein HIF-1伪 dalam osteoblas paska stimulasi BMP9, kami mengkultur sel MC3T3-E1 tanpa kehadiran atau kehadiran Chrysin, aktivator PHD yang banyak digunakan atau NSC697923, penghambat spesifik ubiquitinasi yang dimediasi XIAP.
Pra-perawatan dengan Chrysin jelas mengurangi ekspresi protein HIF-1伪 pada sel MC3T3-E1 yang dirangsang oleh BMP9 dan hipoksia. Di sisi lain, pra-perawatan dengan NSC697923 tidak mempengaruhi induksi protein HIF-1伪 oleh BMP9, namun menghambat ekspresi protein HIF-1伪 yang diinduksi hipoksia.
Sebagai faktor transkripsi, HIF-1 伪 secara langsung bekerja dalam ekspresi berbagai gen termasuk beberapa regulator angiogenesis dan glikolisis. Untuk menilai signifikansi fungsional dari induksi HIF-1伪 pada osteoblas paska stimulasi BMP9, kami membuat kondisi konockdown atau nil-ekspresi gen Hif-1伪 yang dimediasi siRNA dalam sel MC3T3-E1 sebelum stimulasi BMP9. Penurunan ekspresi protein HIF-1伪 dibandingkan dengan kontrol siRNA dikonfirmasi oleh analisis western blot. Kami kemudian menggunakan siRNA ini untuk menganalisis efek knockdown Hif-1伪 pada profil ekspresi gen sel MC3T3-E1 yang distimulasi BMP9. Khususnya, kami menemukan bahwa tingkat ekspresi mRNA dari enzim glikolitik Pdk1 meningkat oleh BMP9 dalam 24 jam, yang secara signifikan menjadi berubah oleh kondisi knockdown Hif-1伪. Di sisi lain, ekspresi gen anggota PDK lainnya (Pdk2-4) tidak meningkat oleh BMP9, sedangkan ekspresi gen Pdk4 sedikit berkurang.
Kami kemudian berusaha untuk memeriksa peran HIF-1伪 dan PDK-1 dalam proses diferensiasi osteoblastik yang diinduksi BMP9 dengan memeriksa ekspresi gen penanda osteogenik. Hasil ekspresi mRNA Hif-1伪 dan Pdk1 mengkonfirmasi keefektifan siRNA spesifik untuk gen ini. Hasil mRNA Pdk1 juga menunjukkan bahwa knockdown gen Hif-1伪 yang dimediasi siRNA secara efektif menurunkan regulasi ekspresi mRNA Pdk1. Kami kemudian menilai derajat diferensiasi osteoblas dengan tingkat ekspresi mRNA dari gen terkait osteogenesis. Penurunan signifikan dalam level mRNA terdeteksi untuk tiga faktor transkripsi yang mengatur diferensiasi osteoblas.
Hasil ekspresi mRNA ini menunjukkan bahwa baik ekspresi HIF-1伪 maupun PDK1 penting untuk diferensiasi osteoblastik yang diinduksi oleh BMP9. Temuan ini menunjukkan bahwa PDK1 adalah mediator utama dan esensial dari peran promotif HIF-1伪 dalam proses diferensiasi osteoblas yang diinduksi oleh BMP9.
Singkatnya, kami menemukan bahwa stimulasi BMP9 dengan cepat meningkatkan akumulasi protein HIF-1伪 dalam osteoblas, yang berkontribusi pada potensi osteogenik yang kuat dari BMP9. Peningkatan protein HIF-1伪 ini sangat penting untuk induksi enzim glikolitik, PDK1, tetapi tidak untuk VEGF-螒. Temuan kami konsisten dengan laporan sebelumnya oleh Regan et al. (2014), yang menunjukkan bahwa pembentukan tulang yang dipengaruhi oleh HIF-1伪 tidak bergantung pada upregulasi VEGF-伪 atau peningkatan angiogenesis, tetapi bergantung pada perubahan metabolisme seluler. Studi terbaru juga mengungkapkan pentingnya metabolisme glukosa seluler dalam sinyal osteogenik lainnya. Misalnya, sinyal Wnt-Lrp5 dan PTH merangsang glikolisis aerobik, yang mendorong pembentukan tulang pada tikus (Esen et al., 2013, 2015). Laporan-laporan ini, serta temuan kami saat ini, menunjukkan pentingnya luas induksi glikolisis aerobik di antara berbagai sinyal osteogenik.
Penulis: Muhammad Subhan Amir
Identitas Jurnal: Journal of Cellular Physiology, DOI: 10.1002/jcp.30752, Accepted: 3 January 2022 (Early view)
Judul asli: HIF1伪 plays an essential role in BMP9恗ediated osteoblast differentiation through the induction of a glycolytic enzyme, PDK1
