Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi protein, yang dihasilkan dalam berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein , memodifikasi urutan gen. Pembentukan protein rekombinan dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vektor dalam penelitian ini di gunakan bakteri e coli, sedangkan osteopontin merupakan protein dalam sperma yang sangat penting untuk keberhasilan fertilisasi, aktivasi sel telur, dan perkembangan embrio serta dapat menjadi penanda status kualitas semen pada sapi. Secara teoritis untuk menghasilkan protein rekombinan relatif mudah,yakni dengan mengambil gen yang diinginkan, mengkloningnya dalam vektor ekspresi, mengubahnya menjadi inang pilihan, dan menginduksinya sehingga protein siap untuk pemurnian dan karakterisasi. Namun dalam pelaksanaannya, banyak kesalahan yang dapat terjadi. Berawal dari pertumbuhan inang yang rendah dan pembentukan badan inklusi, protein yang diperoleh tidak aktif dan terkadang tidak mendapatkan protein.
Banyak faktor yang mempengaruhi hasil protein rekombinan yang diperoleh, dan kualitas salinan DNA yang akan disisipkan ke dalam bakteri merupakan salah satu faktor yang sangat menentukan. Semua prosedur penyalinan DNA, yakni amplifikasi, harus dilakukan dengan benar. Apabila semua reagen telah ditambahkan dalam konsentrasi yang benar, dua komponen penting PCR akan mempengaruhi hasil amplifikasi gen. Pertama adalah template asam nukleat, yang harus berkualitas memadai dan tidak mengandung penghambat Taq DNA polimerase, yang merupakan enzim atau komponen penting dalam proses amplifikasi DNA. Hal kedua adalah pemilihan primer oligonukleotida. Proses ini seringkali penting untuk keberhasilan uji coba PCR secara keseluruhan karena tidak akan ada produk PCR tanpa set primer fungsional.
Memilih set primer oligonukleotida PCR yang optimal bisa membutuhkan waktu yang lama, oleh karena itu, seringkali memerlukan bantuan dengan analisis komputer. Faktor utama yang mempengaruhi fungsi oligonukleotida – yaitu, suhu lelehnya dan kemungkinan homologi di antara primer – adalah tugas yang jelas dan mudah yang dikodekan secara efisien dalam perangkat lunak komputer.Setelah komputer menyediakan sejumlah kecil set kandidat utama, seleksi dilakukan secara manual. Mengingat pentingnya pemilihan primer, penelitian ini berfokus pada desain awal dan pemilihan suhu annealing yang optimum untuk mendapatkan protein rekombinan fungsional.
Isolasi DNA total diuji kualitasnya menggunakan elektroforesis dengan konsentrasi agarosa 1%. . Hasil elektroforesis gel 1% menunjukkan pita di atas penanda 10.000 bp, menunjukkan bahwa total DNA yang diisolasi memiliki ukuran lebih dari 10.000 bp. Sebagai standar panjang dasar, tangga DNA 1Kb ditambahkan ke kode M di sumur pertama. Konsentrasi Agarosa yang digunakan sebesar 1% karena ukuran total DNA pada sapi taurus Bos diketahui relatif besar. Ini membutuhkan kepadatan gel yang rendah agar DNA dapat berpindah dari kutub negatif ke kutub positif selama elektroforesis.
Konsentrasi DNA dapat dihitung secara akurat melalui spektrofotometri serapan sinar ultraviolet. Metode yang sering digunakan untuk menentukan kemurnian DNA adalah dengan menggunakan rasio absorbansi pada 260 dan 280 nm (A260nm/A280nm). Perbandingan antara satuan serapan dengan panjang gelombang 260/280 menunjukkan kontaminasi protein atau RNA, dimana 1,8 – 2 adalah nilai superior dan di bawah 1,8 menunjukkan kontaminasi protein. Sebaliknya, 2 di atas berarti kontaminasi oleh RNA. Demikian juga dengan rasio 260/230 menunjukkan tingkat kontaminasi polisakarida, dimana lebih dari 2 adalah nilai superior dan dibawah 1,8 menunjukkan kontaminasi polisakarida.18 Dari total 13 sampel yang telah diekstrak, kami mengukur konsentrasi rata-rata total DNA dari sekitar 30 mg/uL.
Proses amplifikasi ini merupakan kunci pengkodean gen OPN sebagai kandidat gen yang akan disisipkan ke dalam plasmid dalam pengujian sebagai protein rekombinan. Plasmid yang dipilih dalam penelitian ini juga berperan dalam transkripsi gen saat gen tersebut disisipkan dan merupakan transporter ke dalam sel. Kloning gen juga merupakan langkah awal yang selalu dilakukan dalam penelitian molekuler yang bertujuan mempelajari karakteristik suatu gen. Kloning gen umumnya dilakukan dengan plasmid. Plasmid memiliki situs restriksi yang dapat digunakan untuk kloning gen. Kompatibilitas plasmid mempengaruhi keberhasilan kloning gen dengan gen rekombinan dan kompatibilitas sel inang dengan plasmid rekombinan. Penelitian ini mendapatkan gen osteopontin diamplifikasi pada 860-880 kb (suhu band-annealing target pada 65潞C) menggunakan primer OPN1. Primer SPP1 lainnya, namun, gagal menghasilkan pita DNA yang menunjukkan kegagalan penyalinan DNA selama amplifikasi. Berdasarkan hasil penelitian ini, primer akan digunakan untuk membuat rDNA untuk membuat osteopontin rekombinan melalui transformasi menjadi bakteri E. coli.
Penelitian ini berhasil mendapatkan gen osteopontin yang diamplifikasi pada 880 kb (target band-annealing temperature 65潞C) menggunakan primer OPN1. Namun, primer lain, SPP1, tidak berhasil menghasilkan pita DNA yang menunjukkan kegagalan penyalinan DNA selama amplifikasi. Berdasarkan hasil penelitian ini, primer akan digunakan untuk membuat rDNA untuk membuat Osteopontin rekombinan pada proses selanjutnya yaitu OPN1.
Penulis : Dr. Tatik Hernawati, Drh., M.Si
Informasi detail dari penelitian ini dapat dilihat pada tulisan kami di DOI : 10.5530/pj.2023.15 . Optimization of Osteopontin Recombinant Protein as a Candidate Supplementation for Semen Preservation. Tatik Hernawati, Tita Damayanti Lestari, Suzanita Utama, Rimayanti. Pharmacogn J.2023; 15(4)
